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微生物與石油化工，自動化篩選未來可期
目前石油微生物學的應(yīng)用研究包括溢油修復(fù)、發(fā)酵罐和濕地烴處理、揮發(fā)性烴的生物過濾、微生物增強石油采收率，脫硫和脫氮，煤炭加工，精細化工生產(chǎn)和基于微生物群落的場地評估等。本次小編針對微生物在石油化工方面的應(yīng)用進行簡單概述，以方便為微生物高通量篩選及篩選方案的制訂提供一定的參考。
硫是原油中含量豐富的元素之一。通過化石燃料燃燒在環(huán)境中釋放有害的硫氧化物（SO2）會加劇空氣污染，在世界范圍內(nèi)造成嚴重的生態(tài)危害問題。燃料中存在的硫酸鹽顆粒物也會通過腐蝕降低發(fā)動機的壽命。傳統(tǒng)化學工藝加氫脫硫（HDS）將化石燃料中的硫轉(zhuǎn)化為污染較小的化合物硫化氫，但需要高溫高壓，投資巨大、運行成本高，同時二苯并噻吩（DBT）和4,6-二甲基二苯并噻吩（DBT）難以從石油中去除。
生物脫硫（BDS）可在溫和的加工條件下降低燃料難熔有機化合物的含硫量，具有更大的成本效益。脫硫細菌可利用DBT及其衍生物中的硫來維持其生長并獲得能量，具有“Kodama途徑"和“4S途徑"2種。Bordoloi NK等人從石油污染土壤中分離出一種新細菌螯合球菌屬，可以在多種噻吩化合物中生長，產(chǎn)生2-MBP而不是2-HBP作為最終產(chǎn)品，對細菌的毒性要小得多，同時減少環(huán)境污染，具有中溫生長條件下柴油燃料生物催化脫硫的潛在應(yīng)用，并降低BDS過程中能耗。
重質(zhì)原油的真空渣油餾分是油的粘度大的主要原因。而烷基硫化物橋中C-S鍵的特異性微生物裂解，在該部分中形成鍵，可能導致粘度急劇降低。從油污染環(huán)境中分離出一種獨特的細菌菌株，紅球菌屬菌株JVH1，它使用雙-（3-五氟苯基丙基）-硫化物（PFPS）作為的硫源氧化為亞砜，然后在裂解C-S鍵之前氧化成砜，形成醇，并可能形成硫酸鹽，從中提取硫進行生長。微生物降解重質(zhì)原油以降低粘度的潛力被認為在微生物增采率（MEOR）中非常有效，早期研究基于三個廣泛領(lǐng)域：
油藏中微生物的注入、擴散和繁殖；
選擇性降解油類成分，改善流動特性；
以及微生物產(chǎn)生代謝物及其影響。
嗜熱孢子形成細菌可以在油藏中非常不好的條件下繁殖，因此它們是適合提高稠油采收率研究的微生物。通過微生物這種極低的運行成本技術(shù)的方法，可以在占世界石油總儲量67%的油藏中提取高達50%的殘余油。此外，其他的微生物系統(tǒng)也被廣泛研究用于實驗室和采油現(xiàn)場測試。
表1：實驗室和MEOR應(yīng)用
烯烴加氫是石油精煉中的一個重要過程，但也存在催化劑中毒、大量傳輸限制、發(fā)熱以及與氫氣、儲存和催化劑等相關(guān)的各種障礙。由于這些原因，使用工程微生物在體內(nèi)進行烯烴加氫已成為能夠克服這些障礙的潛在替代方案，此外，隨著合成生物學工具和高通量篩選（HTS）技術(shù)變得更加經(jīng)濟實惠和容易獲得，大腸桿菌或釀酒酵母等微生物越來越多地被用于在工業(yè)規(guī)模上生物合成具有重要商業(yè)意義的氫化烯烴的酶，包括老黃酶、烯酮還原酶和脂肪酸烯酰還原酶。
在耐熱嗜酸古生菌中分離出的香葉基香葉酰還原酶（GGR），可以不對稱地還原2,3-二-O-香葉基香葉酰甘油磷酸鹽中的所有八個異戊二烯基單元，GGR也可以減少由于甲羥戊酸或DXP途徑合成的多種基于C15-C20異戊二烯的中間體，GGR在約55℃時表現(xiàn)出最佳活性，因此需要進行大量的酶工程來改善其性能，使其用于大腸桿菌或釀酒酵母等工程微生物菌株以生產(chǎn)各種飽和聚異戊二烯化合物。通過開發(fā)新的篩選工作流程，用來確定與工程化GGR蛋白庫相關(guān)的酶活性和產(chǎn)物形成譜。通過使用Biomek FX液體處理工作站搭配PhyNexus Ni-IMAC tips（20 μL resin bed）對過濾后的細胞裂解液中的GGR進行純化，隨后使用Biomek FX從WebSeal Plate + 96孔玻璃包被孔板中轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液至384孔板中進行液相萃取。
在檢測步驟，使用Echo將環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)物“打印"涂覆在薄層二氧化硅上，根據(jù)環(huán)氧化程度進行色譜分離，并與發(fā)色團共價連接，從而可以檢測具有獨特產(chǎn)物分布或增強還原酶活性的酶變體。經(jīng)過GC-MS驗證，這種基于薄層色譜的篩選可以區(qū)分選定突變體酶活性的四倍差異。相比于LC/GC-MS復(fù)雜的工作流程和分析時間，使用Echo納升級聲波移液系統(tǒng)和薄層色譜搭建的自動化96孔篩選平臺極大地提高了檢測速度，使并行多個樣品檢測即時可視化，讀值結(jié)果更可靠，成為一種高效的篩選流程。
圖1：靶向SaGGR（源自嗜酸熱硫化葉菌的香葉基香葉基還原酶）中L377X（377位亮氨酸）的密碼子飽和誘變文庫高通量篩選方案
圖2：Echo聲波噴射液滴的優(yōu)化和時程分析中的應(yīng)用。a，通過Echo轉(zhuǎn)移到二氧化硅-TLC板上的考馬斯染色劑。確定50 nL為同時進行48孔TLC分析的最佳體積。b, 30 μM WT SaGGR與2 mM法尼醇一起孵育的時程測定，每分鐘用環(huán)氧化試劑淬滅，并在單獨的泳道中點樣。隨著測定演化到其48分鐘的終點，對應(yīng)于H環(huán)氧化物衍生物的條帶H0-, H2-和H4-FOH用Rf(1)、Rf(2)和Rf(3)表示，并分別增加強度，而副產(chǎn)物帶 Rf(s2)和Rf(S3)隨時間保持相對恒定。c, 從b中描述的時間過程得出的氣相色譜圖描述了法呢醇（H0）、di-(H2)和四氫法尼醇(H4)
石油中的碳氫化合物成分在活組織中持久、生物積累和生物放大，并對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響。使用細菌等微生物進行生物增強是一種新興方法，可以減輕環(huán)境來源的毒素。降解碳氫化合物的細菌、藻類、酵母和真菌在海洋、淡水和土壤生態(tài)系統(tǒng)中含量豐富。通過連續(xù)稀釋法，Hussain N等人從受污染加油站土壤中分離石油降解菌蠟樣芽孢桿菌，培養(yǎng)72小時時生物量最大，并可去除75%石油，并通過生化表征，確定了該菌存在甲烷、甲基環(huán)己烷、甲苯、二甲苯和苯降解途徑。相對于傳統(tǒng)對總石油烴采取的緩解措施如浮選、超聲處理、焚燒、動電修復(fù)、微波頻率加熱、熱解吸，以及合成洗滌劑/表面活性劑、土壤沖洗技術(shù)和光催化去除組成的物理化學方法，這一生物修復(fù)技術(shù)更加經(jīng)濟高效環(huán)保。
表2：文獻中報道的石油烴降解細菌
早在2010年，使用大腸桿菌作為生產(chǎn)生物體，葡萄糖作為碳源，從發(fā)酵罐的廢氣中回收異戊二烯并合成橡膠，實現(xiàn)生產(chǎn)生物異戊二烯。與異戊二烯形成聚合物用于生產(chǎn)丁基橡膠的是異丁烯（2-甲級丙烯），后者是許多化學品的關(guān)鍵前體，也可作為燃料，目前通過石化裂解原油大規(guī)模生產(chǎn)，但同樣在2010年Global Bioenergies公司為其生物基異丁烯發(fā)酵生產(chǎn)研究申請了，由于異丁烯在發(fā)酵條件下是一種氣態(tài)化合物，因此很容易從生物反應(yīng)器中回收，與使用化石原料相比，可再生生物基生產(chǎn)為化學品和燃料的可持續(xù)生產(chǎn)提供了有趣的替代方案。
生物異丁烯的形成被證明是由異戊酸脫羧、3-羥基異戊酸酯的脫水和異丁醇脫水催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化形成，負責酶是微粒體細胞色素P450、甲羥戊酸二磷酸脫羧酶MDD和油酸水合酶等。在細胞色素P450作為NADPH還原酶產(chǎn)生異丁烯的菌株篩選測試時，Fukuda等人從80屬的178個測試菌株中總共篩選出33種真菌、31種酵母和6種細菌在有氧條件下產(chǎn)生了微量異丁烯。MDD是一種參與麥角甾醇或低等異戊二烯生物合成的酶，雖然MDD家族存在于多種微生物種，但這些微生物都不會自然產(chǎn)生異丁烯，通過合成方法Bobik等人設(shè)計了一種合成方法，將MDD脫羧活性表達到大腸桿菌底盤細胞，通過3-羥基異戊酸鹽誘導異丁烯生物合成。異丁醇脫水轉(zhuǎn)化通常使用酸、氧化鋁、二氧化硅催化劑和金屬鹽等在大于100℃下完成，但從假單胞菌屬的腦膜敗血伊麗莎白金菌中純化出的油酸水合酶克隆并表達在大腸桿菌中，可對上述催化反應(yīng)進行生物基生產(chǎn)替代。分子生物學工具和遺傳可及性的可用性對于促進菌株開發(fā)計劃的快速進展至關(guān)重要，同時，為了實現(xiàn)菌株高通量構(gòu)建和篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化，高通量平臺的搭建也至關(guān)重要。
BioLector XT高通量微型生物反應(yīng)器與Biomek i5自動化工作站整合系統(tǒng)，助您實現(xiàn)在線培養(yǎng)監(jiān)測和培養(yǎng)基制備的全過程自動化。
微生物培養(yǎng)自動篩選平臺，支持生物信號實時跟蹤，提高實驗結(jié)果可重復(fù)性，助您輕松設(shè)計并開展高度精確實驗。
基于BioLector XT微型生物反應(yīng)器的在線實時信號（如生物量、pH值、溶解氧濃度、實驗時間、熒光信號等），系統(tǒng)可單獨觸發(fā)取樣、加樣操作（如添加誘導劑或補料溶液）或接種，而無需暫停振搖。
塑料是石化產(chǎn)品制成的聚合物，為現(xiàn)代社會帶來方便的同時，塑料垃圾及塑料污染也極大影響人們的生活。全球每年生產(chǎn)約3.8億噸塑料垃圾，由于其低自然降解特性，目前處理方式有填埋、焚燒，這將會造成地下水、土壤和空氣污染。通過研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲幼蟲可以在短時間內(nèi)消化和降解塑料，采用一種基于氧化還原指標2,6-二氯苯吩多苯酚的新篩選方法，從昆蟲幼蟲中分離出一種聚乙烯降解細菌——Acinetobacter guillouiae。
塑料的烷烴主鏈結(jié)構(gòu)可被烷烴單加氧酶羥基化生成醇，醇經(jīng)醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為醛，該醛經(jīng)醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為脂肪酸，然后脂肪酸通過脂質(zhì)代謝途徑降解，蛋白質(zhì)組學研究表明，當塑料是可用的碳源時，參與烷烴和脂質(zhì)代謝的酶的表達水平在微生物中會上調(diào)。烷烴羥基化和醇脫氫是聚乙烯降解的關(guān)鍵步驟。除此之外，綠銅假單胞菌也是是一種有效的PE降解微生物，可降解如PVC、聚氨酯和聚3-羥基丁酸酯。
常見的一種熱性塑料對苯二甲酸乙二醇酯PET所生產(chǎn)的豐富的日常產(chǎn)品中80%以上都是一次性使用，而全球每年2500百萬噸每年的PET產(chǎn)品消費量也導致了塑料廢物危機。發(fā)展新可持續(xù) 生物基方法將廢碳增值成工業(yè)小分子是一種優(yōu)雅的經(jīng)濟的創(chuàng)建循環(huán)化學品方法。通過化學和解聚的生物學方法進行生物升級再造技術(shù)，將生活和工業(yè)PET中的對苯二甲酸酯廢棄物使用大腸桿菌底盤微生物生物轉(zhuǎn)化為工業(yè)化學品和尼龍前體己二酸（AA）正在成為可能，同時，由于AA每年的消耗約為260萬噸，且多用于材料、藥品香水和化妝品行業(yè)，因此從可再生原料中生物生產(chǎn)AA方案十分有吸引力。
小結(jié)
通過以上內(nèi)容我們不難發(fā)現(xiàn)，微生物在石油化工的各個方面都正在扮演重要角色，極大影響石油化工生產(chǎn)等多方面的效率，同時，也為改善由于泄露等導致的污染問題提供了及其重要的治理角色。
我們不妨可以發(fā)散一下思維，在微生物以及合成生物學快速發(fā)展的當今，高通量篩選的自動化即將加速微生物在石油化工領(lǐng)域的應(yīng)用與創(chuàng)新。從生物原件處理、基因編輯菌株構(gòu)建系統(tǒng)、蛋白表達純化及表征系統(tǒng)、質(zhì)譜前處理及代謝產(chǎn)物檢測系統(tǒng)和菌種發(fā)酵條件優(yōu)化系統(tǒng)全流程，貝克曼庫爾特生命科學具有成熟的經(jīng)驗和落地案例，可幫助加速石油化工菌株篩選、生物轉(zhuǎn)化和生物基生產(chǎn)等過程。
參考文獻（上下滑動閱覽）
